制備柱是色譜分離技術中的核心部件,主要用于從混合物中分離、純化并收集目標化合物(毫克至克級),與分析柱(僅用于檢測)有顯著區別。
定義:內裝固定相(如硅膠、C18填料、離子交換樹脂等)的柱狀裝置,在高壓或常壓下通過流動相驅動樣品分離。
作用:
大規模分離:處理樣品量遠大于分析柱(通常 >100 mg/g填料)。
目標物收集:分離后直接收集高純度組分。
使用注意事項
? 1. 裝柱與填料選擇
填料匹配性:
根據目標物極性選擇固定相(如正相硅膠、反相C18)。
生物大分子純化:優先選擇大孔徑填料(>300 Å)。
裝柱均勻性:
濕法裝柱需排除氣泡,干法裝柱需分段壓實,避免柱床斷層。
? 2. 樣品處理與上樣
樣品溶解:
溶劑需與流動相兼容(如避免水相樣品注入正相體系)。
濃度控制:通常 ≤5% 柱體積,避免超載導致峰變形(示例:50 mm內徑柱上樣量 ≤2 mL)。
過濾預處理:樣品溶液需經 0.22/0.45 μm濾膜 過濾,防止堵塞篩板。
? 3. 流動相與流速優化
參數 要求
流速:按柱尺寸調整(公式:流速∝(制備柱ID/分析柱ID)²)
溶劑純度:HPLC級溶劑,避免雜質污染目標產物
梯度洗脫:緩慢梯度(0.5-1%/min)以提高分辨率
? 4. 分離過程監控
檢測器聯動:
紫外檢測器(UV)設定適宜波長,避免目標峰遺漏。
示差折光檢測器(RID) 適用于無紫外吸收化合物。
餾分收集:
按時間或峰型觸發自動收集,避免交叉污染。
? 5. 柱維護與壽命延長
清洗程序:
每日使用后:用強溶劑沖洗(如反相柱用甲醇-水90:10沖洗30分鐘)。
長期保存:填充儲存溶劑(如反相柱存于甲醇中)。
篩板維護:
定期拆下篩板,超聲清洗(10%異丙醇水溶液,10分鐘)。
? 6. 故障預防與處理
問題現象 原因與解決方案
柱壓異常升高:篩板堵塞 → 反沖或超聲清洗;填料塌陷 → 重新裝柱
峰展寬/拖尾:樣品過載 → 降低上樣量;柱效下降 → 再生填料
回收率低:目標物吸附殘留 → 用強溶劑(如含0.1% TFA的乙腈)沖洗
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